通過內(nèi)毒素選擇性親和吸附劑來清除內(nèi)毒素應(yīng)該是可能的，并能保證蛋白質(zhì)幾乎100%回收。為了清除不同細(xì)菌和菌株來源的內(nèi)毒素，所采用的吸附劑必須與內(nèi)毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)能較好地匹配，所以應(yīng)選用針對內(nèi)毒素共有基團(tuán)的選擇性親和配體，以識別內(nèi)毒素的保守結(jié)構(gòu)成分，這對于那些未知種類的內(nèi)毒素大多也是可以成功的。

1.多黏菌素B

多黏菌素B的抗菌活性針對革蘭陰性細(xì)菌，通過插入細(xì)菌的細(xì)胞壁，降解破壞細(xì)菌胞壁，其表面的活性環(huán)行肽能打破內(nèi)毒素聚合物。由于多黏菌素B和脂質(zhì)A之間能相互作用，所以它是一個(gè)能識別不同來源內(nèi)毒素的基團(tuán)選擇性配體。在各種被污染的革蘭陰性細(xì)菌培養(yǎng)濾液中（1～10mg/L），用多黏菌素B作為吸附配體，清除因素超過105。Talmadge和Siebert對此進(jìn)行了分批試驗(yàn)，結(jié)果顯示在有10g/L的BSA或人IgG存在情況下輸入6000~6700EU/ml（≈0.6～0.7mg/L）濃度的內(nèi)毒素，使接觸時(shí)間為16h，其清除因素大約為103左右，且只能在此水平上下輕微改變。而對不同的單克隆抗體溶液，內(nèi)毒素的清除因素明顯不同。如抗馬過氧化物酶抗體和抗人絨毛膜促性腺激素抗體（濃度分別為2.1g/L對20EU/ml內(nèi)毒素和0.5g/L對61EU/ml內(nèi)毒素），在20mmol/L磷酸緩沖液（pH6.5）中，內(nèi)毒素分別被清除到0.3EU/ml和6EU/ml，清除因素分別約為100和10。

有研究者報(bào)道，從小牛過氧化氫酶中清除內(nèi)毒素的清除因素超過1000。內(nèi)毒素血癥患者的血漿也可以用此方法，洗脫下來的物質(zhì)主要是具有神經(jīng)毒性和腎毒性的多黏菌素B以及單核細(xì)胞刺激釋放的IL-1。此外，在流經(jīng)多黏菌素B層析柱時(shí)蛋白質(zhì)也會丟失，比如過氧化氫酶丟失24%，BSA丟失20%。這是由于這些配體具有陽離子特性而與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)發(fā)生電荷間相互作用的結(jié)果，這也是為什么即使從DNA質(zhì)粒預(yù)備物中可去除200～10000倍的內(nèi)毒素而DNA的回收率卻僅約50%的原因。

2.組胺和組胺酸

早在1968年Kanoh等就曾將組胺和組胺酸用作了配體，他們發(fā)現(xiàn)，核苷酸和內(nèi)毒素間有相互作用。后來，在1982年，Minobe等也發(fā)現(xiàn)除腺嘌呤、胞喀啶等核苷酸堿基外，組胺和組胺酸也能同樣成功地使內(nèi)毒素從各種微生物培養(yǎng)過濾液中去除。雖然，組胺是一種良好的吸附劑，但它們隨后轉(zhuǎn)變成組胺酸時(shí)才真正具備生物活性。組胺和組胺酸用作內(nèi)毒素的吸附劑與多黏菌素B同樣能有效對各種蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行去污染，包括血清白蛋白、胰島素、溶菌酶、肌紅蛋白和另外一些清除因素在5～200（主要因蛋白質(zhì)含量和環(huán)境條件而異）之間的物質(zhì)。

1990年，Matsumae等報(bào)道了有關(guān)分別檢測產(chǎn)物回收情況和內(nèi)毒素去除情況的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在與多黏菌素B同時(shí)存在時(shí)，不能很好地獨(dú)立檢測到蛋白質(zhì)的恢復(fù)和內(nèi)毒素的去除情況。其他實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)顯示，蛋白質(zhì)的存在對于內(nèi)毒素的去除有很大的影響，比如在有BSA存在的時(shí)候，內(nèi)毒素的清除因素減少超過10倍以上；在有鼠IgG1（PI=5.5）存在的情況下，如果是在中性環(huán)境里，清除內(nèi)毒素根本就無效。同樣，緩沖鹽溶液對清除效果也是有一定影響的。

Minobe等采用了各種配體進(jìn)行內(nèi)毒素的清除，雖然它們的去除效果相似，但化學(xué)結(jié)構(gòu)卻十分不同。他們認(rèn)為，內(nèi)毒素結(jié)合的機(jī)制可歸因于疏水作用和電荷作用的協(xié)同，主要是具有腔隙（space）的二氨乙烷（DAH）和咪唑的作用。組胺和組胺酸在這種吸附功能下并不必要。DAH腔隙自身也是有效的吸附物質(zhì)，在一種以聚乙烯醇（PVA）為基礎(chǔ)的膜系統(tǒng)支持下，對含有1130EU/ml內(nèi)毒素的10%細(xì)胞色素c溶液和含85EU/ml內(nèi)毒素的20%HAS溶液去污染，內(nèi)毒素分別被去除5000倍和100倍。另外，有人也證實(shí)DAH和其他一些二氨鏈烷類對內(nèi)毒素的有效吸附是由于離子間作用和疏水作用協(xié)同起作用的，但他們沒有提供有關(guān)從蛋白質(zhì)溶液中清除內(nèi)毒素的數(shù)據(jù)。Petsch等于1997年發(fā)現(xiàn)，組胺酸配體的功能與其咪唑環(huán)上所帶的正電荷有關(guān)。如果在一個(gè)不帶正電荷的環(huán)氧乙烷諳腔隙混合情況下，只有在pH值≤5的時(shí)候才有明顯的清除效果，此時(shí)咪唑環(huán)已被解離（pKI=6.0）。

3.多陽離子配體

從分子動(dòng)力學(xué)方面來看，與蛋白質(zhì)相比，有三維結(jié)構(gòu)的內(nèi)毒素是相當(dāng)穩(wěn)定的，這在吸附過程中起到關(guān)鍵性的作用。有資料顯示，雖然吸附在0.5mol/L的NaCl溶液中被有效抑制，但仍有一小部分內(nèi)毒素在高鹽濃度環(huán)境下（濃度>1mol/L的NaCl溶液）被吸附。配體和內(nèi)毒素由于長距離的電荷作用而隨后產(chǎn)生短距離的相互作用是可能發(fā)生的。次級結(jié)合是在內(nèi)毒素改變結(jié)構(gòu)以適合于吸附劑表面的超微結(jié)構(gòu)后通過另外的范德華力和氫鍵而實(shí)現(xiàn)的。用作內(nèi)毒素吸附的吸附劑只有在某種嚴(yán)格的條件下（30%的乙醇加上1mol/LNaOH）才能成功地被清潔。這一點(diǎn)提示，在親和配體和內(nèi)毒素之間準(zhǔn)確的結(jié)構(gòu)匹配并不必要。由此可見，內(nèi)毒素選擇性配體應(yīng)與多離子分子疏水部分的特性相符合。

事實(shí)上，一些陽離子多聚體已成功地被用作配體（如圖35-2）。Mitzner等采用聚乙二胺（PEI）固定在纖維素小滴上，在體外從血清中清除內(nèi)毒素，與多黏菌素B在生物超級相容性方面有相似的作用。與組胺不固定的纖維相比，PEI不固定在纖維素上，故可較多地從BSA溶液中去除內(nèi)毒素，此時(shí)對離子作用力的依賴較少。肌球蛋白、γ球蛋白和細(xì)胞色素c溶液幾乎能完-全清除內(nèi)毒素（達(dá)95%以上），最終內(nèi)毒素僅留下≤0.05μg/L，同時(shí)有98%的蛋白質(zhì)可被保存下來。

與配體組胺、組胺酸、多黏菌素B和DEAE在一個(gè)較高的蛋白質(zhì)保存水平上相比，多聚L-賴氨酸（PLL）表現(xiàn)出略好的從BSA溶液中清除小量內(nèi)毒素的能力。與DEAE離子交換相比，PLL吸附劑在蛋白質(zhì)結(jié)合能力耗盡之后仍是有用的。與多聚L-組氨酸（PLH）和多黏菌素B相比，用高相對分子質(zhì)量的PLL（相對分子質(zhì)量為150000~300000）預(yù)包裹的微板能更好地促進(jìn)與內(nèi)毒素的結(jié)合。

最近，Hirayama等進(jìn)一步將PLL引入一種多聚基質(zhì)中從而改變常規(guī)用的多聚基質(zhì)，他們認(rèn)為可能有更好的效果。Karl等報(bào)道，無鎬固定的PLH比表面固定有鎬的PLH更能促進(jìn)從BSA溶液中去除內(nèi)毒素。PLH是一種相當(dāng)昂貴的配體，在堿性環(huán)境（O.1mol/LNaOH）下不穩(wěn)定。

多陽離子與內(nèi)毒素間相互作用的原理可能與細(xì)胞和細(xì)胞碎片間的絮凝作用相類似。在絮狀沉淀反應(yīng)開始時(shí)，多陽離子-多陰離子復(fù)合物形成，然后進(jìn)行水分子的替代，最后形成絮狀物，這個(gè)過程也被稱為復(fù)雜凝聚。如果這個(gè)過程也發(fā)生于不固定的多聚陽離子和內(nèi)毒素時(shí)，復(fù)合物也會從溶液中析出來。這就解釋了在這些吸附劑和選擇性陽離子配體蛋白質(zhì)的熱力學(xué)實(shí)驗(yàn)中觀察到的其結(jié)合位點(diǎn)的高親和力現(xiàn)象。

4.具有陽離予功能基團(tuán)的聚基質(zhì)

Hirauyama等用了三年的時(shí)間發(fā)現(xiàn)，通過球形多孔的聚γ-甲基-L-谷氨酸作為吸附劑，比以組胺酸和聚氨基葡萄糖為基礎(chǔ)的市售內(nèi)毒素吸附劑有更強(qiáng)的內(nèi)毒素結(jié)合能力，而且較少依靠離子力（工作范圍也相應(yīng)增加至0.4mol/LNaCl），并對BSA的選擇性更好。此外，通過改變反應(yīng)條件而形成帶有小孔的珠狀形式可以阻止蛋白質(zhì)滲透至孔系統(tǒng)，這樣便可獲得高回收量的帶負(fù)電荷網(wǎng)的蛋白質(zhì)，同時(shí)內(nèi)毒素也被強(qiáng)力吸附。作者由此得出結(jié)論：高效的內(nèi)毒素清除能力是由于內(nèi)毒素聚合物牢固地吸附于吸附劑表面，而BSA與吸附劑的結(jié)合能力相當(dāng)?shù)退隆?/span>

帶電荷的功能性基團(tuán)固定于側(cè)鏈上使得酯鍵的化學(xué)活性不穩(wěn)定是相當(dāng)不利的，所以原位清除（CIP）在pH值高或低的情況下都不適合。N，N-二甲胺丙-腈/N-丙烯胺的應(yīng)用是近年來新興起的。改變這兩種單體的比例可以調(diào)節(jié)電荷的密度，或者改變珠形物的孔徑都是對內(nèi)毒素的清除有利的。在溶液pH值=7，μ=0.05的條件下，通常內(nèi)毒素的去除可以達(dá)到96%～99%，0.5g/L BSA中的殘余內(nèi)毒素的量小于1EU/ml，肌球蛋白、γ球蛋白和細(xì)胞色素c和其他蛋白質(zhì)的恢復(fù)率達(dá)到或超過99%。

配體固定于微濾過膜也能形成帶陽離子功能基團(tuán)的多聚體，膜的內(nèi)側(cè)面（通常是流經(jīng)孔的壁）最初被一個(gè)親水多聚物如右旋糖苷、羥基纖維素或聚乙烯醇等覆蓋。然后，小配體如組胺酸、脫氧膽酸、多黏菌素B或DEAE等，或者是多陽離子配體如PLL或PEI在親水的多聚物網(wǎng)中失去活動(dòng)性。整個(gè)網(wǎng)絡(luò)就如陽離子多聚體一樣工作，配體相對分子質(zhì)量的高低并不十分重要。雖然這些膜吸附劑具有陽離子特性，能夠吸附帶陰離子網(wǎng)的蛋白質(zhì)，但是在蛋白質(zhì)結(jié)合能力耗盡之后并未發(fā)現(xiàn)與配體PEI、PLL，甚至DEAE所結(jié)合的內(nèi)毒素被取代下來。相應(yīng)的吸附等溫線顯示出內(nèi)毒素和蛋白質(zhì)獨(dú)-特的結(jié)合位點(diǎn)。在理想的環(huán)境條件下，由于配體對蛋白質(zhì)的結(jié)合力弱，蛋白質(zhì)的回收率幾乎接近100%。采用配體的內(nèi)毒素去除法較少依賴溶液的pH值和離子力，例如，血清白蛋白溶液在中性條件下能不受蛋白質(zhì)在此pH值時(shí)變?yōu)閹ж?fù)電荷的影響而仍有較好的純化效果。