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凝膠法常用的方法有三種,即試管法、玻片法及毛細吸管法。
試管法
將等量的被檢樣品與鱟試劑加入試管,混勻,放入水浴中讓其充分反應(yīng),然后取出觀察凝膠形成的情況。實驗時共需作四種試管,即試驗管、陽性對照管、陰性對照管及陰性抑制對照管。
試驗管:取標本0.1ml+鱟試劑0.1ml。一般的標本如水、注射液等,實驗前不須加以處理,但血液及腹腔滲出液等實驗前必須加以處理,因為在這些標本中可能會有LT(Limulus test,鱟試劑法)反應(yīng)的抑制物質(zhì)。應(yīng)用的鱟試劑應(yīng)事前以標準內(nèi)毒素進行標定,并認為是可用的。
陽性對照管:標準內(nèi)毒素0.1ml+鱟試劑0.1ml。標準內(nèi)毒素用前應(yīng)以WHO標準品標定。所用的內(nèi)毒素濃度按鱟試劑的敏感性而定,一般為1~5 ng/ ml。
陰性對照管:無熱原水0.1ml+鱟試劑0.1ml。
抑制對照管:標本0.1ml+標準內(nèi)毒素0.1ml+鱟試劑0.2ml。
上述四管均放入37℃孵育1~2小時觀察結(jié)果。如形成凝膠堅固,試管倒轉(zhuǎn)180度不變形,則記為(++);如混濁度和粘滯性明顯增加,呈膠體狀,但傾斜試管時變形,則記為(+);如液體流動自如,透明無變化或稍混濁,有少量顆粒細絮片狀物,則記為(-)。
如被檢樣品中有抑制物存在,則可將檢品作適當?shù)南♂尰蚪?jīng)各種處理以除去抑制物,再次測試。如這些方法無效,亦可采用其它內(nèi)毒素檢測法,如RT(Rabbit pyrogen test,家兔熱原實驗)法。
玻片法
鑒于試管法耗費鱟試劑量多,結(jié)果判定不易標準化,需用時間較長等缺點,Frauch于1974年首先創(chuàng)用了玻片法。將10μl鱟試劑與已處理過的被檢樣品10μl滴于無菌無熱原的玻片上,充分混勻,水平放置37℃30分鐘,取出觀察結(jié)果。如標本中含有內(nèi)毒素,則混合物形成凝膠,倒轉(zhuǎn)玻片時混合物不流動,觸之較結(jié)實。反之則說明樣本中不含內(nèi)毒素或內(nèi)毒素含量過低。
Goto等于1977年對此法進行了兩點改進。①增加鱟試劑及樣品的量,所用量各為20μl。由于Frauch法僅用10μl的鱟試劑及10μl的被檢標本,量太少,且形成凝膠后其體積更小,不易判斷結(jié)果。故各增加鱟試劑及被檢標本量1倍,這樣結(jié)果判定更正確、容易些。②使用不含硅的玻片。由于硅玻璃組成的玻片,滴加在其上的液體可向四周擴散,而顯得不規(guī)則。不含硅的玻片可使滴加在其上的液體保持穩(wěn)定,不向四周擴散,這樣,為結(jié)果的判斷提取了方便。
毛細吸管法
此法由瑞典學(xué)者Gardi于1980年首先創(chuàng)用。將10μl被檢標與10μl鱟試劑滴于無菌無熱原的載玻片上,充分混勻,然后以毛細吸管吸入其內(nèi)(一般為2/3的高度),水平37℃孵育45-60分鐘,取出毛細吸管,再浸入溴酚染料中2~3秒鐘,取出即可判斷結(jié)果。如染料能進入毛細吸管,則說明樣品中無內(nèi)毒素或所含的內(nèi)毒素量低于鱟試劑檢測的敏感度記為(-);如有堅固凝膠形成以致染色不能浸入,即說明樣本含有內(nèi)毒素,記為(+)。此法敏感性高、操作簡便、所需試劑量少、孵育時間短,結(jié)果判斷較客觀。
我們實驗室于1982-1983年間應(yīng)用毛細吸管微量測定法對臨床的多種標本進行了內(nèi)毒素檢測,結(jié)果較為滿意,認為此法值得在臨床上廣泛推廣。
目前,日本已有專門的內(nèi)毒素微量檢測管出售,這種毛細吸管內(nèi)已裝有微量的凍干鱟試劑,只需將此管插入液相標本,取出孵育一定的時間后即能判斷結(jié)果。